基因載體是基因工程的核心，也是基因治療中強有力的生物工具，我們先來認識和閱讀載體圖譜吧。

一、 載體分類及載體組成元件載體分類1、按屬性分類:病毒載體和非病毒載體病毒載體是一種常見的分子生物學工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進入目的細胞，進行感染的分子機制。可發(fā)生于完整活體或是細胞培養(yǎng)中?？蓱糜诨A研究、基因療法或疫苗。用于基因治療和疫苗的病毒載體應具備以下基本條件: (1)攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒; (2)介導外源基因的轉(zhuǎn)移和表達; (3)對，人體不致病;(4)在環(huán)境中不會引起增殖和傳播。非病毒載體一般是指質(zhì)粒DNA.2、按進入受體細胞的類型分類:原核載體、真核載體、穿梭載體(含原核和真核2個復制子，能在原核和真核細胞中復制，并可以在真核細胞中有效表達)。3、按功能分類:克隆載體、表達載體克隆載體:具有克隆載體的基本元件(Ori， Ampr, MCS 等)，可以攜帶DNApian段或外源基因進入受體細胞并克隆和大量擴增DNApian段(外源基因)的載體。

表達載體:克隆載體中加入一些與表達調(diào)控(具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序)有關(guān)的元件即成為表達載體。載體組成元件1、復制起始位點Ori:即控制復制起始的位點。Ori 的箭頭指復制方向，其他元件標注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄方向(正向)。2、抗生素抗性基因:可以便于加以檢測，如Amp+，Kan+ (1) Ampr:水解β -內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。(2) tetr :可以阻止四環(huán)素進入細胞。(3) camr:生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。(4) neor (kanr):氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。(5) hygr: 使潮霉素β失活。3、多克隆位點: MCS克隆攜帶外源基因片段，它具有多個限制酶的單- -切點，便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。還要再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一-般只能容納小于10kb的外源DNApian段。- -般來說，外源DNApian段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。4、P/E: 啟動子/增強子5、Terms:終止信號6、加poly(A)信號:可以起到穩(wěn)定mRNA作用示例閱讀載體: pENTER載體1)human ORF + pENTE載體2)CMV啟動子，T7啟動子3)ORF的C端融合了Flag和His tag4) 多克隆位點,常用AsisI和MluI(人源基因上不常見的) 4) SV40 poly(A) 加尾信號5) SV40 啟動子啟動的puro標記6) 2 個腺病毒ITR序列和2個與腺病毒Ad5同源的序列，可用于將ORF序列同源重組到腺病毒載體，直接.用于腺病毒的生產(chǎn)。慢病毒載體1) EF1a啟動目的基因(可添加小標簽FL AG或HIS等小標簽) 2) CMV啟動GFP,非融合抗性篩選標記Puro (便于做細胞株的穩(wěn)篩) 3) WPRE(來自土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件)，放置在目的基因的上游，能加強轉(zhuǎn)基因的表達4) cPPT (來自HIV-1整合酶基因)，增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)，提高病毒滴度5)第三代慢病毒載體，載體中還包含HIV-1 基因組中的順式調(diào)節(jié)元件(ψ包裝信號和LTR長末端重復序列，其中3’LTR增強子功能缺失，5' LTR中U3區(qū)替代為CMV,更加安全的病毒載體)腺相關(guān)病毒載體AAV表達載體包括了中兩個ITR+CMV(可替換其他組織特異性啟動子，見改造載體部分) + globin intron內(nèi)含子序列+目的基因+ poly A序列二、選擇和準備載體選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時還要考慮載體中應有合適的限制酶切位點等。如果構(gòu)建的目的是要表達-一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。選用哪種載體，還是要結(jié)合目的基因及載體特點以實驗目的為準繩。載體選擇主要考慮下述3點: 1、構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。2、載體的類型:

(1)克隆載體的克隆能力- -據(jù)克隆片段大小(大選大，小選小)。尤其對于病毒載體來說，載體包裝容量的大小是評估能否成功包裝病毒的首要因素。①腺病毒可以插入長約8kb的外源基因。目前，我們包裝過長度為7.5kb外源基因的腺病毒。②慢病毒的包裝容量約為6kb(包含載體帶有的其他抗性基因或報告基因)，但是2kb以上的外源基因包裝慢病毒難度就增加了，增大1kb會下降1個單位數(shù)量級的滴度，故2kb以上的基因包裝慢病毒需要進行評估。此外，毒性蛋白、調(diào)亡蛋白和膜蛋白(作為受體、轉(zhuǎn)運蛋白行使功能)等由于其本身的功能，包裝可能會有一定難度.③AAV的總包裝容量是4.7 kb( 包含載體中兩個ITR約0.3kb具體啟動子+內(nèi)含子約0.6kb +具體熒光標簽+polyA約0.2kb)，所以插入目的基因- -般約2kb左右。由于.AAV包裝容量有限，目的基因大于2kb,可考慮去除內(nèi)含子，因為內(nèi)含子只是有助于插入的目的基因穩(wěn)定表達。

(2)確定表達蛋白的目的，然后再來選擇優(yōu)勢的表達質(zhì)粒。- -般分為原核表達和真核表達質(zhì)粒，前者主要用于體外純化蛋白，如帶His-tag的PET系列，帶GST-Tag的PGEX系列，選用不同的表達載體，就得建立相應的純化系統(tǒng)，包括緩沖液的配置、珠子/柱子的選擇等等，還得考慮目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。這種原核純化的蛋白一般用來制備單一 -的、 需要量大的蛋白。真核表達載體一般是細胞、體內(nèi)表達等需要時所用，只需要將它放到細胞或體內(nèi)細胞即可，weiyi- 考慮的是它的啟動子的選擇，常用都是cmv啟動子的，表達效率較高，也有多種啟動子經(jīng)過改造的表達載體，一般用來表達需要調(diào)控表達時間及表達量的蛋白。

3、載體MCS中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于連接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體(1-1 .5kb)→不易損壞，在細菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體);②- -般使用松弛型質(zhì)粒在細菌里擴增不受約束，- -般10個以上的拷貝，而嚴謹型質(zhì)粒<10個;③必需具備- - 個以上的酶切位點，有選擇的余地;④必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因。選擇載體還需注意: 無標簽載體，起始/終止密碼子都要添加!標簽在N端的載體，終止密碼子要添加!標簽在C端的載體，起始密碼子要添加! (詳細解讀如下)①對于無起始密碼子和終止密碼子的基因，插入無標簽的載體要加入起始密碼子和終止密碼子。②載體N端有標簽，上游引物要對讀碼框;下游 引物要加終止密碼子(為了保證基因的表達,少翻譯載體序列)。鏈接:對讀碼框是為了防止移碼，是不是移碼要看載體圖譜，看酶切位點。從AtG開始，要保證三個堿基編碼的氨基酸不能影響插入目的基因的正常編碼，若影響了插入目的基因的正常編碼就要在設計引物的時候在酶切位點前或者后插入一一個或者兩個堿基，總之是不能影響插入目的基因的正常編碼蛋白。有的酶切位點含有起始密碼子，如果標簽在C端像Nco I就有-一個ATG，這時候需要加堿基在酶切位點后面。③載體C端有標簽，上游引物要加起始密碼子，且考慮是否加Kozak序列(真核表達系統(tǒng));下

游引物要對讀碼框，并且要去掉基因本身的終止密碼子(保證C端標簽表達)。鏈接: Kozak序列是位于真核生物mRNA5’端帽子結(jié)構(gòu)后面的一段核酸序列，通常是GCCGCCRCC (常見的序列是GCCACC)，位于起始密碼子(ATG)之前。它可以與翻譯起始因子結(jié)合而介導含有5’帽子結(jié)構(gòu)的mRNA翻譯起始。在真核生物中，該序列相對比較保守。對應于原核生物的SD序列(原核基因在mRNA5’端起始密碼子AUG上游一段對mRNA的翻譯起作用的序列)。添加Kozak序列的好處:核糖體需要Kozak序列進行穩(wěn)定結(jié)合有助于提高真核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。三、改造載體1、改造啟動子:一般在過表達載體中CMV屬于廣譜型的強啟動子，具體可根據(jù)實驗需求，選用不同啟動子，尤其是對于AAV載體構(gòu)建時選用組織特異性啟動子。